O que é cariótipo?
Cariótipo é o nome dado ao conjunto de cromossomos em uma célula. Esta análise pode ser solicitada em diferentes situações:
- Após uma perda fetal, para o diagnóstico de anomalias cromossômicas em um aborto espontâneo.
- Durante o pré-natal, para diagnóstico de suspeita de cromossomopatia no bebê.
- Após o nascimento, para confirmar a presença de uma síndrome genética no bebê.
- Durante a investigação da fertilidade do casal, para identificar uma possível causa cromossômica de infertilidade, como translocação por exemplo.
A avaliação do cariótipo é realizada a partir de uma cultura de células que possibilita a obtenção de metáfases (células em divisão) e posterior coloração dos cromossomos com bandamento.
Tipos de análise da perda fetal
Apesar de existir uma padronização dos nomes dos testes, a referência à técnica da análise pode gerar confusão. Basicamente existem duas possibilidades, o estudo citogenético clássico (cariótipo com cultivo celular) ou por técnicas moleculares como Sequenciamento de Nova Geração – NGS.
Estudo citogenético do aborto
O estudo citogenético da perda fetal exige a cultura celular do material de restos ovulares para a realização do cariótipo. Esta é a técnica conhecida como clássica por ser a mais antiga e, apesar de continuar em uso, apresenta uma série de desvantagens ligadas à necessidade de cultura celular.- Se as células não crescerem em cultura, não é possível chegar a um resultado conclusivo. Por esta razão, o teste apresenta resultados em apenas 58% dos casos.
- A amostra de aborto pode estar contaminada pelo tecido materno gerando risco associado de resultados falso-negativos (não é possível determinar se o cariótipo 46, XX é referente a paciente ou ao feto).
- A amostra deve ser enviada imediatamente ao laboratório para análise sob o risco de impossibilidade de obter resultados.
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Estudo molecular do aborto (POC)
Através da tecnologia de NGS é realizada uma “leitura” do DNA fetal de forma direta, ou seja, sem cultura celular, o que além de reduzir o tempo de resposta do exame, apresenta vantagens que não são possíveis de obter através do estudo citogenético:
- Maior taxa de informatividade pois não há necessidade de cultura celular que pode falhar devido a contaminação ou ausência de crescimento celular.
- Descarta contaminação materna, pois quando um resultado normal é obtido na análise do produto da concepção, é realizada uma comparação com a amostra de sangue da paciente através de marcadores genéticos do tipo sequências curtas repetidas em tandem (STRs).
- Caso exista a impossibilidade de envio imediato, a amostra pode permanecer na geladeira por até 72 horas e ser encaminhada ao laboratório de genética em temperatura ambiente.
Técnicas moleculares para investigação do abortamento espontâneo
Ao contactar os laboratórios de genética muitas vezes nos deparamos com diferentes siglas que confundem o entendimento do estudo a ser realizado. Algumas delas são:
- Reação em cadeia da polimerase fluorescente quantitativa (QF-PCR): é uma variação da PCR convencional e se baseia na amplificação de pequenas sequências repetitivas do genoma, os STRs. Esses marcadores são utilizados nas amostras de DNA que são amplificadas por PCR, os produtos marcados são separados por eletroforese capilar onde o tamanho e fluorescência dos alelos é analisado com o auxílio de um software específico. O método é quantitativo, portanto, um padrão de alelos de dois picos iguais dentro da mesma região cromossômica é indicativo de euploidia (número normal de cromossomos) para o cromossomo estudado. A limitação desta abordagem é a impossibilidade de avaliar todos os cromossomos de uma única vez.
- Amplificação de múltiplas sondas dependentes de ligação (MLPA): é uma técnica semi-quantitativa e não automatizada, usada para determinar o número relativo de cópias de DNA, até um máximo de 60 sequências de DNA numa única reação de multiplex PCR. A amostra de DNA é hibridada a uma mistura de sondas com amplificação posterior dos produtos de ligação por PCR. Em seguida, tais produtos são separados em aparelho de eletroforese capilar e podem ser analisados em relação aos controles sem alteração, a partir de programa específico de genotipagem. Dados de área ou altura de pico de cada produto de amplificação podem ser utilizados na normalização, e refletem o número relativo de cópias de cada sequência-alvo. O MLPA é mais utilizado para detecção de duplicações e deleções associadas as síndromes cromossômicas conhecidas para diagnóstico pós-natal.
- Hibridação genômica comparativa por array (CGH-Array) e Polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP): o DNA da amostra problema e controle são marcados com corantes fluorescentes e aplicados sobre lâmina de microarray com sondas representativas de regiões clinicamente significativas ao longo de todo o genoma e detecção de variantes de número de cópia (CNVs) e/ou polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). Os sinais fluorescentes são medidos pelo scanner microarray. Os dados são analisados pelo software específico, gerando os resultados.
- O NGS é o método com melhor custo benefício atualmente pois não é limitado ao número de cromossomos por ensaio, permite a detecção de alterações de até 10 Mb e quando combinado com a análise de marcadores STR consegue descartar aneuploidias, triploidias e tetraploidias.
Como a pesquisa da causa do aborto é realizada na Igenomix?
Na Igenomix, o teste para produtos de concepção é realizado através de duas técnicas moleculares complementares para garantir o máximo de informações. Inicialmente o material da perda é analisado por NGS para identificação de ganhos ou perdas de cromossomos (aneuploidias completas e parciais).
Quando um resultado normal é obtido (46, XX ou 46,XY), é feita uma investigação complementar com marcadores STR para descartar o risco de contaminação materna e eventuais alterações triploidias e tetraploidia a partir da amostra de sangue da paciente que deve ser enviada junto com o material de aborto.
Como é coletada a amostra para o estudo molecular do material de aborto?
A melhor forma de obter uma amostra do material para o estudo molecular é através de uma AMIU, que é o procedimento clínico de aspiração do produto de concepção. No entanto, também é possível obter resultados quando o material é expelido naturalmente ou através de curetagem.
É muito importante que o material seja conservado apenas em soro fisiológico para que o DNA fetal não degrade e que seja enviada também uma amostra de sangue materno para que possamos descartar a contaminação materna.
Em caso de dúvidas, solicitação de kits e esclarecimentos sobre o protocolo de coleta ou envio, escreva para infobrasil@igenomix.com, WhatsApp 11 9 7117 9759 ou ligue para (11) 11 2500 1570.
Larissa Antunes, Assessora científica Igenomix Brasil.
