O óleo de FIV perfeito não deve fazer nada além de proteger o cultivo embrionário. Ele não deve influenciar negativamente os gametas, embriões ou meios de cultura, adicionando componentes indesejados ou removendo componentes necessários. Entretanto, nem todos os óleos são ou agem da mesma forma. Nesta postagem do blog, vou orientá-lo sobre os diferentes tipos de óleo e o que deve ser considerado ao escolher o óleo para sua cultura de FIV.
Óleo como proteção: um golpe de gênio
O uso de óleo para proteger gametas e embriões de fatores externos foi introduzido muito antes de a Fertilização in Vitro se tornar um tratamento de rotina. Uma das primeiras aplicações conhecidas foi em um estudo sobre o impacto de vírus em embriões de camundongos(1) na década de 1960. Foi um golpe de gênio, pois o revestimento de um meio com óleo inerte protege o meio de cultivo da evaporação e da contaminação, mas permite o acesso direto às células cultivadas por meio do óleo.
Que tipos de óleos existem e como eles se diferenciam?
Óleo é um termo que especifica apenas que a substância é um líquido não polar e viscoso. Ele pode ser produzido a partir de materiais animais ou vegetais, pode ser derivado do petróleo bruto (geralmente chamado de óleo mineral) ou pode ser sintético. Os dois principais tipos de óleo sintético são o óleo de silicone e o óleo de poli alfa olefina (PAO).
Os óleos de origem vegetal ou animal geralmente são compostos de triglicerídeos. Isso significa que três cadeias hidrofóbicas de carboidratos estão ligadas como ésteres a uma molécula hidrofílica de glicerol. Eles geralmente não são totalmente saturados, ou seja, contêm ligações duplas, o que os torna sensíveis à oxidação. A oxidação, por sua vez, torna o óleo rançoso, um processo no qual grupos tóxicos, como peróxidos ou aldeídos, são formados na estrutura do óleo. Até onde sei, os óleos naturais não são usados na FIV, mas se forem suficientemente refinados e frescos, poderiam ser úteis.
Óleo vegetal
Os óleos minerais também são derivados de materiais vegetais ou animais, mas esse material se degradou ao longo de milhões de anos, alterando sua composição e estrutura. O petróleo usado para produzir óleos minerais comerciais acumula vários elementos ao longo do tempo, como enxofre e vários metais, alguns dos quais são tóxicos (arsênico, cádmio, chumbo). As moléculas dominantes são os alcanos, que podem ser retos, ramificados ou em forma de anel. Atualmente, os óleos usados para a FIV são, com poucas exceções, óleos minerais altamente purificados.
O óleo de parafina é um tipo de óleo mineral. Os óleos minerais e parafínicos têm a mesma origem; no entanto, o termo óleo parafínico é frequentemente usado para óleos que são mais refinados, o que aumenta sua pureza e os torna menos reativos a ataques químicos, como a oxidação.
Alcanos
Os óleos sintéticos são fabricados em uma planta química a partir de moléculas menores. O óleo de silicone é sintetizado pela polimerização do siloxano com cadeias laterais para a qualidade de óleo desejada. Os óleos de silicone são produzidos principalmente para outras aplicações que não a medicina e podem conter resíduos de cadeia curta que provavelmente serão tóxicos. Eles são bem definidos, inertes e inflamáveis. Os óleos de silicone foram testados na FIV com resultados variáveis. O problema mais provável é encontrar uma qualidade que não contenha contaminantes de baixo peso molecular e que, ao mesmo tempo, não seja muito cara.
Os óleos PAO são sintetizados de forma semelhante ao óleo de silicone, mas a molécula principal é uma molécula orgânica de cadeia curta chamada alfa olefina, produzida pelo refino do petróleo. A diferença em relação ao óleo mineral é que o material de partida é bem definido.
Cromatograma de gás do óleo mineral versus óleo PAO. A distribuição do peso molecular é significativamente menor no óleo de polialfaolefina do que no óleo convencional (mineral).
A desvantagem é o preço mais alto e o fato de os óleos PAO serem produzidos principalmente para uso industrial, onde aditivos como agentes anticorrosivos são adicionados ao óleo. Esses aditivos são quase sempre tóxicos para as células.
Estrutura do óleo PAO sintético
OVOIL HEAVY, desenvolvido sinteticamente para FIV
A matéria-prima do OVOIL HEAVY é um óleo parafínico sintético produzido usando moléculas menores como material inicial. A diferença em relação ao óleo mineral é que o material de partida do OVOIL HEAVY é bem definido e pode receber propriedades e qualidades desejáveis e necessárias para a FIV. Esse processo facilita a garantia de uma qualidade consistentemente alta entre os lotes, enquanto os níveis mais baixos de compostos de cadeia curta reduzem o risco de compostos de cadeia curta potencialmente prejudiciais.
Como encontrar o óleo certo para a cultura de embriões
O óleo mineral é o óleo usado mais frequentemente na FIV. Entretanto, há muita variação entre esses óleos e eles variam em qualidade.
Um bom óleo mineral para FIV consiste em moléculas alifáticas de tamanho semelhante. O óleo é produzido por destilação, seguido de etapas de purificação para remover contaminantes, como enxofre, e, por fim, hidrogenação, na qual moléculas de hidrogênio são adicionadas a todas as ligações duplas, criando um óleo totalmente saturado.
Os óleos totalmente saturados são bastante inertes e não reagem rapidamente em temperaturas normais com, por exemplo, o oxigênio. No entanto, eles ainda são sensíveis à oxigenação, especialmente se mantidos quentes ou sob a luz do sol. Ao contrário da crença popular, a água pode se dissolver no óleo em uma concentração baixa de cerca de 25 ppm (dependendo da temperatura). Normalmente, o óleo usado na FIV já está saturado com água, de modo que não absorve água dos meios de cultura.
Qualidades de mistura ao definir a viscosidade
É importante que o óleo tenha uma viscosidade que facilite o manuseio no laboratório. Há duas maneiras de obter a viscosidade correta do produto final. Ele pode ser produzido com o comprimento e a forma corretos das cadeias de hidrocarbonetos desde o início, para que o óleo obtenha a viscosidade desejada.
Outro método comum é produzir um óleo muito viscoso e depois diluí-lo com óleo de viscosidade mais baixa. Isso funciona bem para a maioria dos usos, mas quando o segundo método é usado para FIV, os hidrocarbonetos de cadeia curta adicionados têm um potencial maior de danificar os embriões, pois são mais voláteis e entram mais facilmente na gota do meio onde os embriões são cultivados.
Possíveis problemas durante a limpeza e o transporte
A maioria dos óleos é limpa imediatamente após o refino. Depois de concluído, o óleo é bombeado para um tanque de armazenamento local e, em seguida, transferido para um caminhão-tanque para ser transportado em tambores até o ponto de enchimento. O óleo também pode ser filtrado para remover as ceras que, de outra forma, lhe dariam uma aparência turva. Infelizmente, caminhões, tubulações e filtros costumam ser usados para muitos produtos diferentes, o que significa que precisam ser limpos e enxaguados entre as execuções de produção.
Um método comum de limpeza é um enxágue rápido com hidrocarbonetos de baixo peso molecular, mas também podem ser usados surfactantes. O resultado é um óleo contaminado com um nível mais alto de hidrocarbonetos de baixo peso molecular ou contendo surfactantes. Ambos têm uma influência negativa sobre os gametas ou o embrião em desenvolvimento.
O armazenamento correto do óleo garante a viabilidade do embrião
Mesmo que o óleo de parafina preparado para FIV esteja totalmente saturado, ele corre o risco de oxidar durante o armazenamento. Conforme mencionado no início, esse processo é acelerado quando o óleo é armazenado em uma temperatura alta e exposto à luz. A oxidação que pode ocorrer é, para mim, como químico, muito interessante. A primeira etapa envolve a formação de peróxido. Os peróxidos são muito reativos e danificam muito as células com as quais entram em contato.
A molécula superior é o peróxido, a molécula inferior é o aldeído
Os óleos de grau alimentício são considerados bons até que o nível de peróxido atinja 10 a 12 meq/kg, mas as concentrações de peróxido necessárias para influenciar negativamente os embriões estão um pouco acima de 0,02 meq/kg. Esses níveis baixos são difíceis até mesmo de medir, a menos que seja usado um equipamento especial. Quando a oxidação continua, os peróxidos são convertidos em aldeídos ou cetonas, moléculas que também têm um alto potencial de atividade biológica.
Na verdade, as duas últimas etapas, a oxidação em ácido carboxílico e dióxido de carbono, tornam o óleo novamente melhor para os embriões.
Para ter certeza de que o óleo é adequado, verifique se ele foi liberado seguindo critérios rigorosos de desenvolvimento embrionário e testes de controle de qualidade relevantes.
Qual é a espessura da camada de óleo mineral necessária para cobrir a cultura?
Em um experimento simples, a água foi colocada em tubos de 14 mL e, em seguida, coberta com 0, 1, 2 … 7 mm de óleo. A taxa de evaporação foi determinada pesando-se os tubos depois de incubá-los a 37°C. Mesmo a camada mais fina (1 mm) de óleo reduz a evaporação, mas é necessária uma camada de 2 mm para proteger completamente a água da evaporação. Quando a camada tiver 3 mm de espessura, a espessura adicional não reduzirá mais a taxa de evaporação.
% de perda de água em função da espessura do revestimento (mm) a 37°C
Em uma segunda série de experimentos, o teste foi realizado a 60°C para acelerar a evaporação e determinar com mais precisão a espessura necessária da camada de óleo. Esses experimentos indicam que uma camada de pelo menos 1,5 mm será suficiente.
% de perda de água em função da espessura do revestimento (mm) a 60°C
Mais informações sobre a importância do óleo sem peróxido para a cultura de embriões
O pesquisador japonês Otsuki e seus colegas tiveram uma taxa de fertilização reduzida e um desenvolvimento embrionário prejudicado quando começaram a usar um novo frasco de óleo em sua clínica de fertilização in vitro. Eles decidiram investigar a causa e descobriram que era devido aos altos níveis de peróxido no óleo.
Faça o download de um resumo de suas descobertas para saber mais sobre porque os altos níveis de peróxido no óleo podem danificar o sistema de cultura e os resultados dos valores de peróxido no óleo de diferentes fabricantes.
Baixe o resumo da pesquisa Ovoil Heavy:
Saiba mais sobre os diferentes tipos de óleo para fertilização in vitro da Vitrolife: Ovoil Heavy e Ovoil.
Referências
R.B.L. Gwatkin, Proc. N.A.S., Vol 50 (1963), pp576-581.
Escrito por Göran Mellbin
Göran faz parte da equipe de pesquisa da Vitrolife. Com sua sólida formação em química e sua capacidade especial de resolver até mesmo as questões mais bizarras, ele faz jus ao título em seu cartão de visita: Especialista Sênior.
