Como o embrião é cultivado nas incubadoras irá afetar os resultados reprodutivos da Fertilização in Vitro. Aqui trataremos de um dos pontos em discussão atualmente ligado às incubadoras time-lapse de última geração em relação às características de umidade na incubação, incubação seca e incubação não umidificada.
O que é a diferença e qual o impacto disso nos embriões?
Hoje existe muita conversa e discussão nas redes sociais sobre o cultivo em incubadoras time-lapse secas e umidificadas. Para trazer informação e evidências, Francesca Bahr, Science and Technology Analyst da Vitrolife Group na Dinamarca, trouxe considerações sobre como cultivar com segurança em incubadoras não umidificadas na última edição do Academy Studio durante o Congresso ESHRE 2024, da Sociedade Europeia de Reprodução Humana e Embriologia. (legendas disponíveis em português)
Quando falamos de umidade e não umidade, não é a questão da umidade o que realmente interessa para o embrião, mas o que estamos realmente discutindo é algo chamado osmolalidade, que essencialmente é a concentração de moléculas por peso de um soluto, neste caso água. Isto é, em oposição à osmolaridade que é por volume, usamos osmolalidade porque o peso não é tão suscetível às mudanças de temperatura.
Na imagem, podemos ver duas gotículas com o mesmo número de moléculas mas pelo peso, a da esquerda tem menor osmolalidade do que a da direita.
Como sabemos, as gotas de meio de cultivo contêm todos os tipos de nutrientes para apoiar o desenvolvimento dos embriões, sais, aminoácidos e açúcares, mas eles também precisam estar em uma concentração que suporte uma tônica igual a do embrião. Então se você usar uma solução hipotônica (com uma concentração muito baixa), a célula começa a eclodir como se você colocasse um glóbulo vermelho na água; e se é muito concentrada, a célula murcha assim como quando você vai à praia e fica na água salgada por muito tempo e seus dedos começam a enrugar.
O que queremos é uma concentração capaz de manter a tonicidade ideal para que os embriões tenham o equilíbrio certo de moléculas dentro e fora com os mecanismos de transporte de água que suportam isso.
Há um limite de osmolalidade que é conhecido por apoiar o bom desenvolvimento embrionário. O limite máximo é de cerca de 300 miliosmoles por quilograma e é isso que é aceito para o cultivo de embriões humanos. No entanto, os embriões também podem usar componentes no meio de cultivo, tanto em osmólitos orgânicos quanto não orgânicos, como a glicina, para controlar a osmolalidade.
Na discussão sobre incubadora seca e umidificada, é fundamental dizer que algumas incubadoras que usam misturadores de gás, como o EmbryoScope na verdade não são secas, porque utilizam uma proporção da umidade ambiente que está incluída neste sistema.
No estudo apresentado na ESHRE em 2008 podemos ver que com uma incubadora umidificada você obtém cerca de 80% de umidade, mas em algumas incubadoras de bancada você obtém um pouco de umidade. No EmbryoScope a umidade é cerca de 25% dada a umidade ambiente do laboratório de 60%.
Não umidificado não sempre significa seco. O único cenário em que você realmente terá uma incubação seca é em uma incubadora de bancada com um gás pré-misturado, onde não há influencia da umidade ambiente.
O que pode afetar a osmolaridade durante o cultivo embrionário?
Precisamos discernir entre incubação seca, não umidificada e umidificada, mas também que há diferentes fatores que podem afetar as mudanças na osmolalidade:
- O óleo no cultivo
Para controlar a evaporação do meio e evitar mudanças de osmolaridade se utiliza a sobreposição de óleo no meio de cultivo. Também é importante o tamanho das gotas, pois se você tiver gotículas terá uma grande área de superfície exposta que pode aumentar a sua evaporação.
O óleo é por si só eficaz em ambientes de cultivo sem umidificação para evitar mudanças de osmolalidade, desde que você tenha uma camada de óleo alta o suficiente.
- A placa de cultivo
O papel da placa utilizada para o cultivo é crucial. Falamos de um exemplo com uma gota que tem uma grande área de superfície, no entanto, nas placas de cultivo da Vitrolife você tem micropoços, expondo uma superfície menor e protegendo uma grande parte através do formato cônico que minimiza a evaporação pelo simples fato de não ter uma área de superfície tão grande.
Existem alguns estudos analisando o papel das placas de cultivo em time-lapse e mudanças de osmolalidade. Cito aqui dois estudos independentes que analisaram diferentes designs de placas e o aumento da osmolalidade ao longo do tempo. Na incubação não-umidificada, a osmolalidade aumentará, mas a questão aqui é quanto aumenta e se permanece num nível seguro.
O primeiro estudo foi uma publicação recente que analisou diferentes placas de cultivo. Se olharmos para a ordem dos métodos e materiais, bem como nossa validação interna, as placas de cultivo de embrião Vitrolife são as que apresentam um ligeiro aumento na osmolalidade, mas de modo que não é suficiente para prejudicar o desenvolvimento embrionário.
Steve Mullen também fez um estudo fantástico. Eu encorajo você a ler este artigo se estiver realmente interessado no assunto, observando o efeito de diferentes fatores na osmolalidade, o que inclui a área de superfície e o volume do óleo, nível de densidade do óleo, entre muitos outros cálculos. A partir disso, criou-se um modelo de cálculo que, se você utilizar, poderá obter uma estimativa das mudanças de osmolalidade no seu sistema de cultivo.
Em relação à segurança, é fundamental comprovar a osmolalidade inicial do meio de cultivo. Alguns meios têm uma osmolalidade inicial muito alta, de 285 a 295 mOsm/kg, enquanto os meios de cultivo GTL e GXL foram projetados especificamente para cultura estendida em time-lapse com uma osmolalidade inicial muito mais baixa que utiliza componentes que os embriões podem usar para prevenir a osmolaridade, especialmente alguns aminoácidos como a glicina.
Concluindo, vemos muitos estudos buscando avaliar o cultivo em incubadoras secas e não-secas, mas estes os estudos às vezes carecem de informações como o tipo de incubadora usada, a osmolalidade inicial do meio utilizado, qual a fonte do gás – se é um gás de pré-mistura que é seco versus se for uma incubadora com misturador de gases, além do método de umidificação. Vejo muitos desses estudos onde nem mesmo relatam o que foi medido, se a umidificação ou a osmolalidade.
Se você estiver operando uma incubadora sob umidificação ou não umidificada, você terá que calibrar seus sensores de CO2 para se ajustar a isso, portanto esta é uma informação que seria fundamental estar contida nos estudos.
Assista o vídeo completo para obter mais detalhes sobre os estudos citados durante a apresentação. Por exemplo, um dos estudos mais citados é o de comparação de ambiente umidificado versus seco. No entando, no sistema de incubação utilizado o ar é recirculado por toda parte, o que inviabilizaria concluir que toda incubação não umidificada é prejudicial em qualquer extensão.
Em termos de validações próprias para osmolalidade, temos a análise usando GTL e Ovoil Heavy desde o início do cultivo até o sexto dia. O aumento na osmolalidade que você pode ver aqui está abaixo da linha limite de segurança aceito, e não chegamos nem perto disso mesmo depois de 6 dias.
Recentemente realizamos estudos com os meios Vitrolife GTL e GXL onde comprovamos diferenças na osmolalidade dependendo dos componentes do meio de cultivo.
Mais um estudo realizado em PCRS incluindo ensaio MEA, onde as células foram contadas após seis dias. Um detalhe importante é dizer que o estudo foi feito em Denver, que é muito seco, resultando em um aumento um pouco maior e ainda assim muito seguro.
Segurança em cada detalhe do processo em primeiro lugar
Cada instrumento que compõe o EmbryoScope passa por um teste MEA, a única incubadora time-lapse que faz teste MEA.
Dicas para o controle da osmolaridade
- Utilize um meio de cultivo apropriado para o uso prolongado de cultivo em time-lapse como o GTL ou GTXL.
- Use óleo suficiente para proteger o meio de cultivo. Isso também significa que, ao pipetar o óleo, você precisa ter cuidado para expelir a quantidade total se usar um óleo mais denso.
- Visite em nosso blog a postagem sobre como manter um cultivo estável.
Vantagens de uma incubadora não umidificada:
- Sem umidade os problemas de contaminação desaparecem.
- Você não precisa dedicar tempo para limpeza e redução de risco. Não há relatos de contaminação fúngica ou microbiana no EmbryoScope e esse é um grande bônus na cultura não umidificada.
Por fim, tenha em conta que o cultivo não umidificado não é ruim e o seca, bom, essa visão é muito generalista. Para determinar o melhor para os embriões é preciso olhar para todo o sistema de cultivo, como ele o suporta e validar seus próprios resultados.
Conclusões:
- Múltiplos estudos demonstram que o sistema de cultivo não umidificado do EmbryoScope suporta um excelente desenvolvimento embrionário.
- A osmolaridade aumenta com o tempo no EmbryoScope, no entanto não atinge níveis de risco.
- Um meio desenvolvido para cultivo estendido deve ser considerado para incubadoras não umidificadas.
- Incubação não umidificada com o uso de um meio de cultivo contínuo tem a vantagem de reduzir o risco de contaminação.
Conte com o suporte clínico do Grupo Vitrolife dedicado para a América Latina para obter os melhores resultados e esclarecer suas dúvidas!
Catherine Kuhn Jacobs é embriologista e suporte clínico do Vitrolife Group na América Latina