A reação em cadeia da polimerase (PCR) revolucionou a análise quantitativa de DNA e RNA. A técnica evoluiu rapidamente nos últimos anos e o crescente interesse em aplicações da PCR favoreceu o desenvolvimento da PCR quantitativa em tempo real, também conhecida como qPCR. Essa técnica é atualmente o padrão ouro para o diagnóstico da COVID-19 de acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS). Confira aqui como ela funciona e suas aplicações.
PCR quantitativa em tempo real (qPCR)
A qPCR é uma derivação das descobertas de Karry Mullis na década de 80 que tem como principais características a detecção e quantificação de fluorescência emitida durante cada ciclo de uma reação de PCR e a sensibilidade de detectar poucas cópias de DNA presentes em uma dada amostra. Se uma pessoa estiver trabalhando com amostra de RNA, inicialmente é necessário realizar a sua conversão para DNA complementar (cDNA) antes com reagentes específicos, etapa conhecida como transcrição reversa (RT). Portanto, a PCR que utiliza o RNA como molde é conhecida como RT-qPCR. Por exemplo, como o Sars-CoV2 é um vírus de RNA, para avaliar seu material genético em uma amostra biológica é necessário fazer essa etapa de transcrição reversa no laboratório.
Após a obtenção da amostra de DNA ou cDNA, na qPCR o ácido nucleico é geralmente colocado em placas de 96 ou 384 poços juntamente com os reagentes para uma PCR convencional, mas a diferença é que será utilizado um reagente específico ao se intercalar na dupla-fita do DNA permite a quantificação do produto gerado após os ciclos de reação. Durante a amplificação, um software constrói em tempo real um gráfico relacionando os ciclos de termociclagem com a intensidade de fluorescência emitida durante a amplificação do DNA nas amostras, ciclo a ciclo.
Atualmente, muitas plataformas estão disponíveis para a PCR quantitativa em tempo real. As principais diferenças entre elas são a velocidade, comprimentos de onda e o número de reações que podem ser executadas em paralelo.
Como interpretar um resultado de qPCR?
Para um ensaio focado na expressão de genes por exemplo, a partir do gráfico gerado ao término da reação, é traçada uma linha de maneira paralela ao eixo referente ao número de ciclos (abscissas), na altura em que se inicia a fase exponencial da amplificação gênica (início da elevação exponencial na emissão da fluorescência). Este parâmetro representa o limiar de detecção, ou seja, o número mínimo de ciclos para amplificação, e é denominado “threshold”.
O ponto em que o “threshold” cruza com a linha de amplificação da amostra, permite determinar o número de ciclos necessários para o início da amplificação da sequência gênica-alvo presente no DNA de cada amostra. Este valor é denominado Ct (“Cycle Threshold”) e permite a quantificação relativa do DNA de cada uma das amostras, após ser corrigido pelos Ct dos genes-controle endógenos e das amostras-controle.
fonte: Thermofisher
O Ct é proporcional ao logaritmo da quantidade inicial de expressão do gene-alvo em uma determinada amostra, quanto menor for o número inicial do Ct obtido do gene-alvo na amostra, é porque houve maior amplificação do gene-alvo e, consequentemente, ele apresenta maior expressão.
Quais as aplicações da qPCR?
Essa tecnologia pode ser aplicada em estudos de expressão gênica, microRNAs, análise de SNPs, mutações pontuais relacionadas a doenças ou câncer possibilitando o melhor entendimento de enfermidades, mecanismos imunes e de processos metabólicos dos organismos em geral.
Detecção de Sars-CoV2
Para a avaliação da presença ou não do material genético do vírus em amostras respiratórias, é necessária a realização de uma coleta de amostra de swab de nasofaringe. Posteriormente, o RNA é isolado e este é convertido em cDNA. Para que possa ser realizada a qPCR para Sars-CoV-2, além dos reagentes de uma PCR convencional, uma variedade de alvos genéticos do vírus é usada por diferentes fabricantes, com a maioria dos testes utilizando um ou mais alvos. Apesar de ser uma tecnologia com boa precisão, falsos negativos podem ocorrer. Para evitar resultados falsos negativos, existem algumas recomendações básicas que publicamos anteriormente.
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Larissa Antunes, Assessora científica Igenomix Brasil.
Referências:
Kubista, M., Andrade, J. M., Bengtsson, M., Forootan, A., Jonák, J., Lind, K., … Zoric, N. (2006). The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine, 27(2-3), 95–125.
